構(gòu)建穩(wěn)定通用高效固氮酶系統(tǒng)方面取得重要進(jìn)展

通過(guò)生物工程方法，改造現(xiàn)有固氮系統(tǒng)，并最終將改造后的固氮系統(tǒng)直接導(dǎo)入到植物的線粒體、葉綠體等靶細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)植物（農(nóng)作物）自主固氮，徹底擺脫農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)工業(yè)氮肥的依賴，是生物固氮研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)“綠色革命”的夢(mèng)想。

合成生物學(xué)的發(fā)展為這一夢(mèng)想的實(shí)現(xiàn)帶了新機(jī)遇。近年來(lái)，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王憶平課題組在這一研究方向上取得了一系列研究成果：1）構(gòu)建了《最簡(jiǎn)鐵鐵固氮酶系統(tǒng)》（Yang et al.， PNAS，2014）；2）實(shí)現(xiàn)了植物源電子傳遞鏈模塊的重構(gòu)及與固氮酶系統(tǒng)的適配性研究（Yang and Xie et al.， PNAS，2017）；3）成功構(gòu)建了《超簡(jiǎn)鉬鐵固氮酶系統(tǒng)》（Yang and Xie et al.， PNAS，2018）。以上研究成果得到了國(guó)際同行的高度認(rèn)可，先后兩次被PNAS作為當(dāng)期封面推薦文章，并在同期PNAS刊登評(píng)論點(diǎn)評(píng)文章（Vicente andDean. PNAS，2017；Burén et al.， PNAS，2018。以上研究成果，使得新構(gòu)建的固氮系統(tǒng)更適合向真核系統(tǒng)乃至農(nóng)作物轉(zhuǎn)化及在真核細(xì)胞器中完成正常組裝的關(guān)鍵需求，讓人類進(jìn)一步看到了徹底擺脫工業(yè)氮肥的曙光。

但是在將固氮酶系統(tǒng)向真核系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）和產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）固氮酶核心酶組分NifD蛋白均無(wú)法在酵母及植物的線粒體中穩(wěn)定表達(dá)。因此，固氮酶系統(tǒng)在真核細(xì)胞器中的穩(wěn)定性成為了新的限制因素。為此，王憶平課題組與合作者開(kāi)展了一系列研究工作。首先，在NifD蛋白序列上確定了其在線粒體中涉及其穩(wěn)定性的相關(guān)區(qū)域，并通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)在該區(qū)域內(nèi)鎖定了一個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基：NifD-R98；其次，發(fā)現(xiàn)NifD蛋白的R98位氨基酸殘基在序列上高度保守，當(dāng)將四種具有代表性的固氮菌來(lái)源的NifD蛋白在酵母線粒體中分別表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)它們均高度不穩(wěn)定，而與它們相對(duì)應(yīng)的R98突變體均可穩(wěn)定表達(dá)，因此推斷R98位導(dǎo)致對(duì)野生NifD蛋白的降解存在普遍性；接下來(lái)以大腸桿菌為底盤，分別重構(gòu)了來(lái)源于酵母、水稻、煙草和擬南芥的功能性線粒體信號(hào)肽酶（mitochondrial-processing peptidase，MPP）的功能模塊；當(dāng)這些MPP功能模塊分別與野生型NifD及其R98突變體組成的固氮酶系統(tǒng)進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)重構(gòu)線粒體來(lái)源的MPP酶直接參與了對(duì)固氮酶核心酶組分NifD蛋白的降解，而其相對(duì)應(yīng)的R98突變體乃至其它固氮酶組分均可穩(wěn)定表達(dá)。由此可見(jiàn)，NifD蛋白在線粒體中的不穩(wěn)定性是由線粒體MPP酶的錯(cuò)誤切割造成的；更重要的是，由于NifD蛋白的R98位氨基酸殘基在結(jié)構(gòu)上負(fù)責(zé)與NifK蛋白的相互作用，暗示著突變?cè)撐稽c(diǎn)的困難程度。因此通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變及活性測(cè)定，最終找到了合適的NifD-R98位變體，它們既可保持較高的固氮酶活性，又能在線粒體中穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)配圖），因此這些NifD-R98位的變體可用來(lái)在線粒體中組裝有活性的固氮酶。此外，該研究首次以合成生物學(xué)手段在大腸桿菌中重構(gòu)了四種定位于線粒體的蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)系統(tǒng)，能夠?qū)δ康牡鞍资欠駮?huì)被MPPs錯(cuò)誤切割做出預(yù)評(píng)估，從而為線粒體定位的異源蛋白穩(wěn)定性測(cè)試提供了便捷工具。

以上研究成果于2020年6月29日在美國(guó)科學(xué)院院刊PNAS以Article的形式在線發(fā)表題為“Using synthetic biology to overcome barriers to stable expression of nitrogenase in eukaryotic organelles”的研究論文，通過(guò)揭示了固氮酶核心酶組分NifD蛋白在真核細(xì)胞器線粒體中異源表達(dá)不穩(wěn)定的機(jī)制，同時(shí)進(jìn)一步篩選到了在線粒體具有高穩(wěn)定性的NifD突變體，從而向構(gòu)建穩(wěn)定通用高效的固氮酶系統(tǒng)又邁出了新的一步，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物自主固氮的最終目標(biāo)進(jìn)一步打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。(100yiyao.com）