新藥開發(fā)的過程是漫長、復(fù)雜和不確定的，高通量篩選(High-throughput screening，HTS)是小分子藥物設(shè)計(jì)中用于發(fā)現(xiàn)起始化合物的策略之一。一般來說，當(dāng)對靶標(biāo)研究較少時(shí)，HTS是首選。根據(jù)與疾病的相關(guān)性，綜合考慮與其他靶標(biāo)的聯(lián)系以及創(chuàng)新性，來進(jìn)行HTS的靶標(biāo)或細(xì)胞模型的選擇。篩選技術(shù)的選擇是由靶標(biāo)的可篩選性及其假定的化學(xué)易變性決定的。不同的篩選技術(shù)適用于不同的靶標(biāo)，對篩選技術(shù)的評述對之后的HTS具有重要的指導(dǎo)作用。
進(jìn)行HTS有一定的先決條件，首先是靶標(biāo)的前期確證，其次是靈敏且穩(wěn)定的篩選方法，最后是結(jié)構(gòu)豐富的化合物庫。在HTS后，還需要對苗頭化合物進(jìn)行進(jìn)一步的確證。常用的方法是重新購買，確認(rèn)純度，測定親和力和濃度梯度實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行多方法的實(shí)驗(yàn)檢測，再去卷積分析排除假陽性。還可以利用靶標(biāo)蛋白的同源家族蛋白突變體等備選進(jìn)行特異性篩選，多向印證化合物的選擇性。
一、生化篩選體系
生化篩選利用純化的靶標(biāo)蛋白，在體外測定配體的結(jié)合或酶活性的抑制。這些分析通常采用競爭形式進(jìn)行，即研究中的化合物必須取代已知的配體或底物。通常使用384孔板進(jìn)行檢測，一般采用20-50 μL的檢測體積，并使用光學(xué)方法讀出，如吸光度，熒光，或發(fā)光。熒光法由于其更易操作、高靈敏度和靈活性，已經(jīng)在很大程度上取代了傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記配體分析方法。常用的熒光檢測方法有以下幾種：
1.總熒光分析（Fluorescence intensity, FLINT）
在固定時(shí)間內(nèi)對孔的熒光值進(jìn)行積分如100 ms。常用于含染料的底物，在酶催化反應(yīng)后生成具有熒光的物質(zhì)，如蛋白酶介導(dǎo)的肽熒光基團(tuán)的裂解。FLINT會(huì)受到許多因素的影響，如被檢測物質(zhì)的自發(fā)熒光和淬滅（與被檢測物質(zhì)相互作用而非底物）以及加樣誤差等。一般來說，用于標(biāo)記的染料的激發(fā)波長越長，從篩選化合物的光譜干擾就越小。
2. 熒光比率法（Ratiometric fluorescence methods）
常見的HTS篩選體系包括熒光偏振（FP）和熒光各向異性（FA）檢測。此方法相較FLINT更不易受人為因素的影響，通過測定分子一定時(shí)間的旋轉(zhuǎn)變化，表征相互作用對測定分子的影響。在這些技術(shù)中，使用偏振光來激發(fā)熒光團(tuán)，并使用平行于和垂直于入射光偏振的偏振器來測量熒光發(fā)射。當(dāng)染料標(biāo)記的分子隨時(shí)間翻轉(zhuǎn)時(shí)，發(fā)射信號會(huì)去偏振。與大分子的結(jié)合降低了熒光團(tuán)的遷移率，從而增加了偏振值或各向異性，并允許定量結(jié)合。因?yàn)椴煌瑹晒馑氐臒晒鈮勖煌么颂匦钥梢宰畲蠡Y選體系的靈敏度。有機(jī)染料如fluorescein和rhodamine熒光壽命約3-4 ns，當(dāng)它們與約0.5-10 kD的分子結(jié)合時(shí)，檢測靈敏度最高。所以熒光比率法最適合用于分子量差異很大的分子間相互作用的測定。
3. 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）
來自熒光供體的能量通過偶極-偶極相互作用被受體吸收。能量傳遞的效率取決于供體和受體之間的光譜重疊，它們的距離和相對方向，以及福斯特方程中的其他參數(shù)。常見的能量供受體距離是26 nm，適合許多蛋白-蛋白相互作用。
4. 時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）
是由熒光共振能量轉(zhuǎn)移衍生而來的一種篩選方法。具有長壽命熒光(通常為100秒到毫秒)的鑭系化合物用作熒光供體，熒光蛋白或有機(jī)熒光團(tuán)(例如，別藻藍(lán)蛋白或Cy5)用作受體。然后對受體的熒光發(fā)射進(jìn)行門控(例如，延遲到50ms)，以便在信號采集時(shí)，被測化合物中短壽命有機(jī)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射已經(jīng)衰減。典型的商業(yè)化合物庫里分子熒光壽命在皮秒范圍內(nèi)。此外，350 nm供體激發(fā)和670 nm受體發(fā)射之間的大斯托克斯位移進(jìn)一步有助于最小化背景信號。鑭系化合物的熒光發(fā)射也表現(xiàn)為多個(gè)窄波長，這與有機(jī)染料的寬波長發(fā)射不同，后者允許與熒光受體進(jìn)行多路復(fù)用。
5. 熒光壽命分析（Fluorescence lifetime analysis, FLA）
一種不太常見但有效的檢測方法，在高通量篩選中，F(xiàn)LA使用時(shí)域數(shù)據(jù)采集來確定樣品中存在的熒光物質(zhì)的壽命。FLA的理想染料是釕絡(luò)合物，其熒光壽命約為20 ns。與熒光強(qiáng)度的測量相比，壽命測量對樣品中其他材料的顏色(如測試化合物)的敏感性要低得多。此外，在分析數(shù)據(jù)時(shí)，兩種生命周期通常都適用，這允許刪除壽命較短的組分，類似于TR-FRET實(shí)現(xiàn)的效果。
6. Alphascreen
熒光發(fā)射的波長比激發(fā)光的波長長，與其相反，AlphaScreen是一種非放射性的基于距離的分析方法，使用單線態(tài)氧敏化在較短的波長上產(chǎn)生發(fā)射，從而避免熒光偽影。待測分子偶聯(lián)在兩種不同的水凝膠包覆微珠上。供體微珠含有光敏劑(酞菁衍生物)，當(dāng)被680 nm的光刺激時(shí)產(chǎn)生單線態(tài)氧。如果受體微珠(包含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物)貼近供體微珠，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光和短的波長的光發(fā)射(520-620 nm)。
二、基于親和力的篩選體系
基于結(jié)合的分析直接觀察庫里化合物與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，而不考慮它們對蛋白質(zhì)功能的影響。上文所述的生物化學(xué)方法則是測量酶/受體功能的改變或探針/蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制。一般來說，基于結(jié)合的測定法使用的生物物理技術(shù)比基于競爭的篩選法更耗費(fèi)材料和時(shí)間，因此最常用于小型化合物庫?；诮Y(jié)合的方法也被用于具有挑戰(zhàn)性的孤兒靶點(diǎn)和藥物發(fā)現(xiàn)過程的后期階段，如苗頭化合物驗(yàn)證、優(yōu)化和先導(dǎo)化合物的優(yōu)化。
1. 基于片段的藥物設(shè)計(jì)(Fragment-based drug design, FBDD)
一種特別適合生物物理方法的應(yīng)用。FBDD涉及片段的篩選，這些片段是小分子(<280 Da)，與蛋白質(zhì)形成弱相互作用，典型的解離常數(shù)在毫摩爾到微摩爾范圍內(nèi)。FBDD利用小化合物庫覆蓋更大的化學(xué)空間(例如,使用103的片段可能達(dá)到105 -106年傳統(tǒng)的HTS化合物庫的效果)，同時(shí)為藥物化學(xué)提供了一個(gè)靈活的起點(diǎn)。片段發(fā)現(xiàn)對于靶向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和傳統(tǒng)化合物庫作用有限的難成藥靶標(biāo)特別有幫助。FBDD中最常用的方法是NMR(核磁共振)、表面等離子體共振和X射線晶體學(xué)。
2. 核磁共振（NMR）
NMR可用于配體檢測和蛋白質(zhì)檢測兩種模式。配體檢測的核磁共振測量在目標(biāo)蛋白存在時(shí)，配體質(zhì)子或其他核磁共振活性核的強(qiáng)度或弛豫的變化，通過從蛋白質(zhì)到配體的磁化轉(zhuǎn)移，稱為奧氏核效應(yīng)。通常使用1H-NMR，使用配體檢測模式，對蛋白質(zhì)沒有大小限制，只需要低濃度的蛋白質(zhì)，也不需要同位素標(biāo)記。但另一方面，基于配體的NMR可能無法區(qū)分特異性和非特異性的結(jié)合作用。雖然蛋白質(zhì)檢測核磁共振更費(fèi)力，但它提供了化合物結(jié)合位點(diǎn)的具體信息，特別是當(dāng)核磁共振峰被分配到特定的蛋白質(zhì)殘基時(shí)。因此，在初次篩選后，蛋白質(zhì)檢測NMR通常作為二次檢測。蛋白質(zhì)檢測NMR最常用的方法是1H-15N和1H-13C異核單量子關(guān)系(HSQC)，它們分別對蛋白質(zhì)主鏈或含甲基側(cè)鏈的化學(xué)環(huán)境變化非常敏感。最近，反膠束封裝已被提出，以擴(kuò)大核磁共振在FBDD中的檢測限度，這可能允許測量離解常數(shù)超過200 mM。
3. 表面等離子體共振（SPR）
一種非常靈敏的方法來實(shí)時(shí)監(jiān)測兩個(gè)物種之間的結(jié)合，且可進(jìn)行高通量篩選。SPR測量金/玻璃/溶劑界面的折射率變化，即光在表面等離子體上損失的角度(“SPR dip”)。在典型的SPR實(shí)驗(yàn)中，小分子或蛋白質(zhì)流過靶標(biāo)或其他結(jié)合物質(zhì)被固定的表面。重要的是，折射率的變化與結(jié)合材料的質(zhì)量成正比；因此，SPR可以測量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。通常，靶蛋白被固定在傳感器上，使用賴氨酸的共價(jià)連接或通過親和捕獲方法，如多組氨酸標(biāo)簽、生物素或Fc受體。這種形式允許每天測量數(shù)百個(gè)分子，但這可能受到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的限制。或者，微陣列固定化化合物文庫提供更高的通量，但需要對文庫進(jìn)行化學(xué)修飾以固定化。為了區(qū)分特異性和非特異性結(jié)合，可以對已知配體進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行突變驗(yàn)證。雖然SPR非常敏感，但它相對昂貴，需要嚴(yán)格控制緩沖液、溫度和懸浮顆粒物。
4. 生物膜層干涉（Biolayer interferometry, BLI）
與SPR原理類似，測量固定蛋白層與內(nèi)部參考層之間的信號干涉。這種技術(shù)更容易使用，但比SPR不敏感，因此通常用于測量蛋白質(zhì)之間的相互作用，而不是蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用。
5. 二次諧波產(chǎn)生（Second-harmonic generation, SHG）
另一種基于板的測量親和力的方法，測量384孔板中固定在脂質(zhì)雙分子層上的染料標(biāo)記蛋白的內(nèi)部總反射率的變化。信號的二次諧波分量對二次諧波活性染料(PyMPO衍生物)相對于表面的取向非常敏感(具有亞埃分辨率)，當(dāng)配體與目標(biāo)結(jié)合并改變其構(gòu)象時(shí)，信號的二次諧波分量會(huì)發(fā)生變化。因此，SHG能夠在化合物庫中篩選變構(gòu)或誘導(dǎo)構(gòu)象改變的分子。
6. 質(zhì)譜分析（MS）
廣泛用于篩選蛋白質(zhì)和小分子間的相互作用。一種常見的形式是親和選擇-質(zhì)譜(AS-MS)，其中蛋白質(zhì)和化合物池孵育，蛋白質(zhì)配體配合物從未結(jié)合的化合物中迅速分離，結(jié)合的配體然后用LC-ESI-MS解離和鑒定。蛋白質(zhì)配體配合物與未結(jié)合配體的分離可以通過多種方法實(shí)現(xiàn)，如超濾或分子排阻層析。另外，蛋白質(zhì)分子加合物也可以在特定的環(huán)境下用質(zhì)譜進(jìn)行測量，如二硫鍵結(jié)合化合物或共價(jià)化合物的篩選。
7. 熱漂移實(shí)驗(yàn)（DSF）
差示掃描熒光法（DSF）和熱漂移實(shí)驗(yàn)（Thermal shift assay, TSA）都是指的這一方法，通過檢測溫度升高時(shí)染料的熒光增加，測定蛋白質(zhì)的去折疊，這種染料與蛋白質(zhì)的疏水部分有親和力，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)展開時(shí)，疏水部分暴露出來，熒光增強(qiáng)。與目標(biāo)物結(jié)合的化合物使其穩(wěn)定并提高熔解溫度。
8. DNA編碼化合物庫（DNA-Encoded Library technology, DEL）
DEL是通過一種均分與合并的方法建立的，化學(xué)支架混合在一起，然后分開進(jìn)入容器為下一輪化學(xué)反應(yīng)。在每個(gè)容器中加入不同的化學(xué)取代物，然后再次合并和均分，以進(jìn)行下一個(gè)反應(yīng)。裂解池化學(xué)的產(chǎn)物是一種復(fù)雜的混合物，它可以包含數(shù)百萬甚至數(shù)十億種化合物。對于DEL，開始的支架被標(biāo)記為獨(dú)特的DNA序列;在每個(gè)反應(yīng)步驟中，添加另一個(gè)DNA序列，作為添加的化學(xué)取代基的條形碼。然后，DNA條形碼編碼的混合物被應(yīng)用到含有感興趣的蛋白質(zhì)的微珠上。沖洗掉未結(jié)合的化合物，洗脫結(jié)合的化合物，并進(jìn)行PCR和二代測序，以確定哪些DNA偶聯(lián)化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合。
9. X射線晶體衍射（X-ray crystallography）
研究小分子/蛋白質(zhì)復(fù)合物的高分辨率方法。雖然X射線晶體學(xué)需要最多的蛋白質(zhì)(毫克)和結(jié)晶是耗時(shí)的，但它可以極大地促進(jìn)配體的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向設(shè)計(jì)，以改善親和力。目前高通量結(jié)晶方法已經(jīng)開發(fā)出來，并且衍射也有相應(yīng)的高通量設(shè)施，不過主要依賴于化合物浸泡（Soaking）的方法實(shí)現(xiàn)。
三、基于細(xì)胞的篩選體系
化學(xué)探針和藥物先導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)不僅可以基于與特定靶標(biāo)的相互作用，也可以基于它們誘導(dǎo)細(xì)胞/生物體表型的能力?；诩?xì)胞/生物體的篩選通常使用在1）理想的分子靶標(biāo)是未知的；2）生化方法不能充分重現(xiàn)靶標(biāo)反應(yīng)體系；3）理想的表型只存在于細(xì)胞背景下，如細(xì)胞分化等。功能性結(jié)果還可以提供大量的機(jī)制信息，如區(qū)分完全激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反向激動(dòng)劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。異質(zhì)性也可以被測量，特別是當(dāng)細(xì)胞可以可視化高內(nèi)涵成像時(shí)。最后，基于細(xì)胞的方法還可以報(bào)告化合物的膜通透性和細(xì)胞毒性，這是基于結(jié)構(gòu)的藥物開發(fā)失敗的主要原因。
基于細(xì)胞的方法可以應(yīng)用在藥物發(fā)現(xiàn)的整個(gè)進(jìn)程中：靶標(biāo)識別和驗(yàn)證、初篩、先導(dǎo)鑒定、先導(dǎo)優(yōu)化以及安全性和毒性篩選。常用的方法如下，細(xì)胞增殖、第二信使、報(bào)告基因、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)、酵母雙雜法和基于顯微鏡的分析。細(xì)胞模型的選擇是至關(guān)重要的。人源建模中，細(xì)胞系通常被改造帶有報(bào)告基因或者其他特征。目前趨勢更多的是建立“疾病樣”模型，包括原代/患者來源的細(xì)胞和涉及3D細(xì)胞培養(yǎng)或多細(xì)胞種類的復(fù)雜培養(yǎng)。人們對使用灌注培養(yǎng)和其他微流體裝置來評估化合物對細(xì)胞的長期影響也越來越感興趣。此外，小動(dòng)物模型，如線蟲和斑馬魚越來越多地被用作小分子篩選的高通量模型。
1. 細(xì)胞增殖（Cell viability）
細(xì)胞增殖常用于鑒定能殺死癌細(xì)胞或病原體的化合物，并可檢測在肝臟等器官中的潛在安全問題。常用有效的活性測定方法是利用熒光素酶/熒光素在ATP依賴的反應(yīng)中發(fā)光來測定ATP含量。熒光素酶的檢測非常敏感(每孔可以檢測到少于10個(gè)細(xì)胞)，可以適用于1536孔板。染料如釕、阿爾瑪藍(lán)、雙偶氮化合物（MTT、MTS、XTT和WST-1）也可用于增殖測定，這些通常轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熒光或者顏色來表明存活或者死亡。細(xì)胞活力也可以通過檢測培養(yǎng)基中釋放的胞內(nèi)酶（蛋白酶，LDH）或用非膜熒光染料插入DNA（如碘化丙啶）來評估。
2. 報(bào)告基因（Reporter gene）
報(bào)告基因分析(也稱為信號通路分析)，報(bào)告蛋白的編碼序列是在相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄控制下引入的。報(bào)告基因的表達(dá)通過檢測發(fā)光或熒光，反映啟動(dòng)子激活或抑制的程度。觀察到的信號是整個(gè)通路的產(chǎn)物，被篩選的化合物可以在任何一點(diǎn)相互作用。常用的報(bào)告基因是CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、GAL(β-半乳糖苷酶）、LAC(β-內(nèi)酰胺酶)、LUC(熒光素酶)和GFP。報(bào)告基因方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，它們通常需要長時(shí)間培養(yǎng)才能轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此增加了間接影響的可能性。最新的發(fā)展方法是使用不同的報(bào)告基因來同時(shí)檢測多個(gè)通路。
3. 第二信使（Secondary messenger）
第二信使法檢測信使分子在通路中的表達(dá)或運(yùn)輸，比報(bào)告基因法提供更相近的響應(yīng)。這種檢測被廣泛用于GPCR靶標(biāo)。例如，如果靶標(biāo)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+存儲(chǔ)，其活性可以直接使用鈣敏感染料(如氟-3，氟-4，基于水母發(fā)光蛋白的發(fā)光)測定。如果GPCR不能自然地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，它可以被設(shè)計(jì)成使用混雜或嵌合G蛋白(也被稱為通用適配器)刺激Ca2+信號。這些方法的一個(gè)特點(diǎn)是其快速的響應(yīng)時(shí)間，這需要在以秒的數(shù)量級內(nèi)整板注入化合物并CCD檢測，如FLIPR或FDSS。較慢的讀出分析，如arrestin或TANGO，也被開發(fā)用于GPCR篩選。熒光測定法已被開發(fā)用于測量其他信使，如K+，或其熒光信號隨膜電位變化的膜結(jié)合染料。
4. 蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析和雙雜交篩選（Protein-fragment complementation）
蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析(PCA，也被稱為雙分子熒光互補(bǔ))和雙雜交篩選可以檢測細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形成/抑制。PCA將單個(gè)檢測蛋白(熒光素酶，GFP, GAL)分成兩部分，融合到感興趣的蛋白質(zhì)互作分子上；如果伴侶結(jié)合，檢測蛋白重新形成，信號可被檢測到。在小分子篩選中，不可使用GFP，因?yàn)檫@兩個(gè)片段不可逆地結(jié)合，不能通過小分子的結(jié)合而解離。最近一種可逆性熒光互補(bǔ)結(jié)構(gòu)被報(bào)道，其通過一種結(jié)合小分子染料的蛋白，增強(qiáng)熒光。雙雜交(2H)篩選是另一種基于活性轉(zhuǎn)錄因子形成的互補(bǔ)方法。在雙雜中，DNA結(jié)合域與誘餌蛋白結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域與靶蛋白結(jié)合。報(bào)告基因(如GAL或LAC)插入啟動(dòng)子后，如果靶蛋白與誘餌結(jié)合，激活域與報(bào)告基因相連，激活報(bào)告基因并能被檢測到。在存在抑制蛋白質(zhì)互作的化合物時(shí)，激活被阻止。
5. 高內(nèi)涵顯微成像（High-content imaging）
HCS儀器自動(dòng)收集在多孔板中生長的細(xì)胞的光學(xué)或熒光圖像;然后，這些圖像會(huì)自動(dòng)分析所選擇的任何可測量特征。典型的儀器可以讀四色熒光2- 40倍的目標(biāo)。寬視野和共焦工具都是可用的，頂級設(shè)備可以讀取到63倍的水浸目標(biāo)。在獲得圖像后，使用定量的圖像分析工具提取特征，并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)?？蓽y量的特征非常多。例如，從單一的DNA結(jié)合染料，可以測量核的大小、形狀、強(qiáng)度和紋理(像素到像素的可變性)。
四、靶標(biāo)識別
在通過基于表型的方法鑒定出有希望的先導(dǎo)化合物系列之后，需要鑒定出相應(yīng)的靶標(biāo)。這些技術(shù)通常用于開發(fā)中的臨床前分子，但同樣可以應(yīng)用于已批準(zhǔn)的目標(biāo)未知的藥物。識別一種化合物的靶標(biāo)將大大有助于理解其生理相關(guān)性，優(yōu)化其親和力，確定脫靶效應(yīng)，以及獲得新藥物的監(jiān)管批準(zhǔn)。靶標(biāo)去卷積方法可分為三大類:化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)和生物信息學(xué)比較法。一般來說，這些方法的結(jié)果是通過敏感的體外試驗(yàn)驗(yàn)證的，如SPR。
1. 化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)（Chemical proteomics）
基于親和的方法是最古老和最直接的方法來闡明小分子靶標(biāo)。在一種流行的形式中，配體被固定在載體上(如磁珠)，與細(xì)胞裂解液孵育，使其與蛋白質(zhì)組相互作用。結(jié)合蛋白被洗脫，用胰蛋白酶消化成多肽，用液相色譜分離，然后用質(zhì)譜和生物信息分析(鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué))鑒定。定量質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)允許比較由生物活性配體拉下的蛋白量與那些結(jié)合到非活性的配體類似物(陰性對照)，從而區(qū)分非特異性結(jié)合。其他以親和力為基礎(chǔ)的形式也有報(bào)道，其中一些涉及到蛋白陣列的標(biāo)記，而不是配體，使用凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，或?qū)ε潴w進(jìn)行化學(xué)修飾，使其能以共價(jià)方式附著在細(xì)胞中的目標(biāo)物上。
基于親和分離的一個(gè)缺點(diǎn)是固定化和衍生化可以影響觀察到的結(jié)合親和。標(biāo)記也需要化學(xué)合成的專業(yè)知識，也可能不兼容所有的配體。在基于活性的蛋白質(zhì)分析(ABPP)中，配體與探針競爭與特定靶標(biāo)類的成員結(jié)合。細(xì)胞熱漂移試驗(yàn)(CETSA)由熱漂移試驗(yàn)衍生來的，其中化合物被添加到細(xì)胞中。細(xì)胞或裂解物被加熱到不同的溫度，并監(jiān)測蛋白質(zhì)的變性。配體的結(jié)合穩(wěn)定靶標(biāo)蛋白，使它們在較高的溫度下才熔解。CETSA可通過凝膠電泳或質(zhì)譜檢測。
2. 生物信息學(xué)分析（In silico comparative profiling）
可以將所研究的分子對細(xì)胞表達(dá)譜或表型的影響與已知生物活性小分子參考數(shù)據(jù)庫中的分子進(jìn)行比較，從而推斷出實(shí)驗(yàn)分子的靶標(biāo)和作用機(jī)制?？捎糜诒容^的表型譜包括遺傳、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和高內(nèi)涵顯微鏡數(shù)據(jù)。
3. 化學(xué)遺傳學(xué)（Chemical genetics）
化學(xué)遺傳方法確定基因表達(dá)水平如何改變化學(xué)制劑的效果。特別是，可以在全基因組范圍內(nèi)增加或減少基因產(chǎn)物的表達(dá)，并監(jiān)測配體誘導(dǎo)的表型變化。與其他靶標(biāo)去卷積策略相比，這提供了獨(dú)特的優(yōu)勢，如不局限于可溶性蛋白，并允許區(qū)分直接和間接結(jié)合物，這為藥物的作用機(jī)制提供了更深入的了解。最初，化學(xué)遺傳學(xué)研究在有限數(shù)量的唯一可行的生物模型像酵母利用包含基因片段的多拷貝質(zhì)粒，或通過比較減少基因的拷貝數(shù)的影響。如今，化學(xué)遺傳技術(shù)包括RNA干擾(RNAi)、條形碼開放閱讀框(ORF)庫和CRISPR篩選，這些技術(shù)能夠以系統(tǒng)和有效的方式干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的所有基因?；贑RISPR和RNAi的方法都適用于匯集篩選，因?yàn)檫@兩種系統(tǒng)(sgRNA或shRNA)的表達(dá)結(jié)構(gòu)都有DNA副本整合到基因組中，它們本身作為分子條形碼，為目標(biāo)基因編碼。
五、未來與展望
進(jìn)行藥物開發(fā)目前有兩條熱門的途徑，其一是根據(jù)基礎(chǔ)研究選擇具有重大意義的疾病靶標(biāo)，特異性設(shè)計(jì)HTS的篩選方法，選擇合適的靶向藥物庫進(jìn)行篩選，利用多重方法進(jìn)行苗頭化合物和先導(dǎo)化合物的鑒定與驗(yàn)證。其二是根據(jù)疾病特征性選擇合適的表型模型，根據(jù)表型的特征性，選擇合適的表型篩選體系進(jìn)行表型篩選實(shí)驗(yàn)，獲得先導(dǎo)化合物后進(jìn)行靶標(biāo)去卷積鑒定和驗(yàn)證作用靶標(biāo)，可再結(jié)合基于結(jié)構(gòu)的藥物篩選進(jìn)行進(jìn)一輪的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提升藥效，綜合各藥物設(shè)計(jì)策略的長處，開發(fā)原創(chuàng)新型藥物。
參考文獻(xiàn)
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110102000668（1）號