等電點(PI)/電荷工程
通常，mAb可以通過非特異性內吞作用進入細胞，然后轉移到內體。非特異性內吞作用的機制不依賴于靶抗原，因此，雖然這種機制有助于清除所有單抗，但其對清除的貢獻率因單抗不同而不同。據報道，通過內吞作用攝取大分子的速率受到電荷/PI的影響。研究顯示陽離子分子(高等電點/正電荷)通過內吞作用表現出比陰離子分子(低等電點/負電荷)更高的攝取速率。給野生型小鼠靜脈注射8株不同等電點的人源化IgG4單抗后進行藥代動力學研究，結果顯示等電點與清除率呈顯著正相關，與半衰期呈顯著負相關（圖1）。此外，在FcRn功能缺陷的B2M基因敲除小鼠中，用4株具有代表性的單抗也證實了PI與清除率或半衰期的相關性以及PI效應與FcRn無關。
圖1. 在普通鼠中不同等電點的人源化IgG4單抗的藥代動力學
組織分布研究評估了不同等電點的mAb的清除途徑，發(fā)現PI較高的mAb在肝和脾這兩個高度血管化的器官中的降解率很高。
因此通過抗體優(yōu)化過程中，降低pI/電荷將是改善mAb藥代動力學的一個有價值的途徑。例如通過在可變區(qū)和恒定區(qū)引入突變，可以降低mAb的等電點/電荷。目前已經報道通過降低等電點或平衡電荷分布可以改善mAb對IL-12/23、 HER2、LTA等靶點的藥代動力學。這里不再詳細表述。然而改變可變區(qū)的氨基酸可能會影響其抗原結合親和力或生物物理性質，而將恒定區(qū)的氨基酸改變?yōu)榉亲匀恍蛄锌赡軙黾用庖咴缘娘L險。因此，在應用PI/電荷工程改善mAb的藥代動力學時應考慮這些因素。
增強與FcRn的結合的抗體工程技術
新生兒Fc受體（FcRn）是一種MH1Like異二聚體，在細胞運輸和IgG的血清半衰期中發(fā)揮核心作用。mAb通?？梢酝ㄟ^FcRn循環(huán)系統(tǒng)從內體循環(huán)回血漿，使mAb在體內表現出較長的半衰期和較低的清除率。雖然FcRn可以將mAb從內體循環(huán)到血漿中，但在酸性pH條件下，通過抗體工程來增加FcRn的結合，進一步提高mAb的回收效率。
在過去的十幾年中，已經報道了一些突變來增強了FcRn在酸性pH條件下的結合，并提高了從內體到血漿的回收效率（圖2）。
圖2. Fc 工程增強抗體與FcRn結合
噬菌體展示Fc變體文庫的篩選鑒定了在pH 6.0下具有增強與人FcRn結合的突變體YTE（M252Y / S254T / T256E）。研究顯示，YTE變體與人和食蟹猴FcRn的結合能力增加了10倍，在食蟹猴PK研究中半衰期增加了4倍。Motavizumab-YTE是一種靶向呼吸道合胞病毒的人源化抗體，是第一種針對FcRn介導的半衰期延長而設計的抗體，已在人類受試者中進行測試。I期臨床試驗結果顯示，相對于Motavizumab IgG1，其半衰期增加2至4倍。而且Motavizumab-YTE和Motavizumab的抗藥抗體(ADA)發(fā)生率相當，提示YTE突變不會增加人類免疫原性的風險。YTE突變的應用對生物利用度也沒有負面影響。YTE突變的缺點之一可能是FcγRIIIA結合減少，導致ADCC活性降低。當ADCC被要求作為一種作用模式時，使用YTE突變應該慎重考慮。此外，−8?C發(fā)現，具有YTE突變的IgG與WT hIgG1相比具有較低的熱穩(wěn)定性，這可能會影響抗體的溶解性和聚集性。
Zalesky等人研究表明M428L/N434S突變(LS)在pH6.0下對人FcRn的親和力增加11倍。當用含有LS突變的抗VEGF抗體處理人FcRn轉基因荷瘤小鼠時, 與IgG1處理的動物相比，觀察到更好的抗腫瘤效果。這是FcRn依賴性半衰期增加導致改善的抗腫瘤活性的第一個體內證明。與YTE突變不同，LS突變保留了與WT IgG1抗體相當的FcγRIIIA結合和ADCC活性。因此，當療效需要ADCC活性時，LS突變比YTE突變更合適。首次用ALXN1210(Raverizumab)研究LS突變對單抗藥代動力學的影響。ALXN1210是一種人源化的具有LS突變的抗補體C5IgG2/4單抗，用于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿和非典型溶血性尿毒癥綜合征。其是eculizumab工程化版本，通過基因工程改造Fc區(qū)域，引入的氨基酸替代(VH_Y27H，VH_S57H，M428L，N434S)導致半衰期延長4倍，允許劑量從每2周減少到每8周一次，同時保持療效。ALXN1210是目前唯一一個通過增加與FcRn的結合改善半衰期而獲得FDA批準的治療性抗體。
另一個提高抗體半衰期的機制是通過Fc工程設計抗體變體，在胞外pH條件下與FcRn不結合，在胞內pH增強FcRn的結合。pH為7.4時IgG的殘留結合已被證明對血漿循環(huán)和循環(huán)持久性有負面影響。這一過程對于需要釋放到血漿中并在那里持續(xù)存在的抗體是有利的，例如，針對細胞結合靶標的抗體。Lee等人合理設計大腸桿菌高通量篩選文庫，以鑒定在pH 5.8而不在pH 7.4時選擇性與FcRn結合的hIgG1 Fc突變。通過這些篩選策略，他們發(fā)現突變體L309D/Q311H/N434S（DHS）在胞內pH與FcRn結合的能力是WT hIgG1的5倍，而在細胞外pH下不結合。在體內， hIgG1-DHS在hFcRn/hβ2M/hFCγR的小鼠中的半衰期是WT hIgG1的4倍以上。與YTE突變不同，DHS突變的抗體同樣保持了FcγR結合的能力以及ADCC活性。
另外也可以設計突變來調節(jié)細胞外pH的結合。識別在細胞外pH下與FcRn有不同結合的抗體變體的一個基本理念是產生所謂的“sweeping 抗體”來清除可溶性靶標。因為使用常規(guī)抗體靶向可溶性抗原的一個不良后果是，它可能會導致抗原量增加。這是由于IgG的半衰期比結合的抗原的半衰期要長得多，從而使得抗體-抗原復合物的積累，由于清除率的減少而增加了血漿抗原的存在。為了改善這一點，通過設計sweeping 抗體，以增強與FcRn在胞內和胞外pH的結合。在pH 7.4時，增加與FcRn的結合可以阻止抗體釋放到血漿中，使其與可溶性抗原形成復合物，抗體-抗原復合物然后可以迅速內化到細胞內。sweeping 抗體通常被設計成一旦內化在內體中就能與抗原解離，從而溶酶體只針對性的降解抗原（圖3）。
圖3.sweeping 抗體作用機制示意圖
研究發(fā)現突變體M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(簡稱YTE-KF)與FcRn的結合在胞內和胞外pH時均增加了20倍。另一個能增強與FcRn結合的hIgG1突變的例子是M252Y/V308P/N343Y突變。與WT-hIgG1相比，在胞外pH條件下與FcRn的結合>2500倍，在內體與FcRn的結合增加了>400倍。在體內，與WT hIgG1抗體相比，攜帶M252Y/V308P/N343Y突變的IL-6R抗體在處理hFcRn轉基因小鼠后，血漿中的人可溶性IL-6R總量降低了1000倍。
如上所述，改善半衰期的FC工程將賦予mAb更長的生物利用度和潛在的治療效果，同時降低了給藥頻率。
pH依賴性解離靶抗原的抗體工程技術
據報道，一些單抗在動物和人身上都表現出TMDD。TMDD常見于靶抗原位于細胞表面(膜結合的靶抗原)，如IL-6受體、EGFR、CD40、CD81、OX40(CD134)等。TMDD消除快，半衰期短，導致血漿/血清抗體濃度低。因此，當TMDD發(fā)生時，需要更頻繁或更高的劑量來維持血漿/血清中抗體的有效濃度。
為了克服在靶向膜結合的靶抗原時這種快速消除的問題，發(fā)明了能夠依賴pH與靶抗原結合的mAb。在這個概念中，mAb首先與膜結合的靶抗原結合，然后與靶抗原一起內化到內體中。然后，在酸性內體(pH 6.0左右)中，mAb與靶抗原解離。雖然靶抗原隨后會被轉移到溶酶體并降解，但解離的mAb與酸性內體中的FcRn結合，并被循環(huán)回到質膜，從FcRn釋放到血漿中。這種方法已經被證明是有效的，可以最大限度地減少TMDD介導的快速消除。
例如通過在常規(guī)人源化IL-6受體IgG1抗體中引入幾個組氨酸突變和其他一些突變，產生了一種新型的具有pH依賴性結合特性的人源化IL-6受體IgG1抗體(稱為循環(huán)抗體)。酸性條件下的組氨酸質子化改變了mAb的結構，改變了mAb與靶抗原的靜電相互作用。人源化的無pH依賴性結合的IL-6受體IgG1抗體tocilizumab，在pH 7.4和6.0, 其KD與人可溶性IL-6R僅相差2倍，而pH依賴性結合的變異體(PH2)的KD則相差22倍。在食蟹猴中，與tocilizumab、tocilizumab-FcRn(tocilizumab帶有N434A突變的tocilizumab)和親和力成熟的tocilizumab-FcRn(與N434A突變的tocilizumab高親和力tocilizumab-FcRn)相比，PH2-FcRn(PH2在Fc中有N434A突變，以增加FcRn在酸性pH下的結合并改善清除率)顯著改善了靜脈和皮下注射后的清除率。盡管單獨增加FcRn結合并沒有改善藥代動力學，但pH依賴結合和增加FcRn結合的組合確實顯著改善了tocilizumab的藥代動力學(圖4)。比較Tocilizumab和PH2-FcRn的IL-6受體中和時間，PH2-FcRn 2 mg/kg可抑制C反應蛋白(CRP)至少4周，而Tocilizumab 2 mg/kg僅抑制CRP 1周。
圖4. pH依賴性抗IL-6受體抗體在食蟹猴中的藥代動力學
Chaparro-Riggers等人報道了一種pH依賴性的抗PCSK9抗體的產生。傳統(tǒng)的抗PCSK9抗體在食蟹猴和恒河猴中的半衰期十分短(分別為2.5天和3.2天)。雖然PCSK9是一種可溶性蛋白，但PCSK9結合會影響PCSK9抗體的藥代動力學。野生型和PCSK9基因敲除小鼠的藥代動力學數據表明，PCSK9介導了一種常規(guī)PCSK9抗體的TMDD。因此，為了最小化PCSK9介導的TMDD，通過對常規(guī)人源化抗PCSK9 IgG2抗體J16進行組氨酸掃描，產生了一種pH依賴的抗PCSK9抗體。研究表明常規(guī)抗PCSK9小鼠IgG1抗體J10在野生型小鼠中的半衰期較短(2.9天)，而pH依賴的抗PCSK9小鼠IgG1抗體J17的半衰期達到14.4天。在FcRn基因敲除小鼠中，pH依賴的PCSK9結合對PCSK9介導的TMDD的改善作用減弱，這表明pH依賴性的PCSK9抗體在酸性內體中從PCSK9中解離出來，并以pH依賴的方式與FcRn結合后，從內體循環(huán)到細胞膜。這些數據表明，pH依賴的PCSK9結合顯著改善了PCSK9介導的TMDD，從而增強了PCSK9抗體的藥代動力學。
以上所述，pH依賴的靶抗原結合對TMDD的影響已經得到了驗證，包括膜結合的靶抗原和可溶性的靶抗原。當在臨床前研究中觀察到TMDD，可以應用pH依賴的靶抗原結合工程來最小化TMDD。
小編總結
本文介紹了三大可以改善抗體藥代動力學特性的抗體工程技術。有三個主要過程決定了mAb的藥代動力學，可以通過抗體工程技術來調節(jié)這些過程。第一個主要過程是非特異性內吞作用，可通過PI/電荷工程進行調節(jié)。第二個過程是FcRn介導的從內體到血漿的循環(huán)，這可以通過在酸性pH下增加FcRn結合來調節(jié)。第三個過程是TMDD，這可以通過與靶抗原的pH依賴性結合來調節(jié)。目前基于這些抗體工程技術的治療性抗體已經顯示出在動物和人類中藥代動力學的改善。相信隨著后續(xù)的研究深入以及臨床進展，它會為患者提供益處，如皮下注射和更長的給藥間隔以及通過減少劑量減輕經濟負擔。
參考文獻
1.Improvement of pharmacokinetic properties of therapeutic antibodies by antibody engineering.
2.Fc-Engineering for Modulated Effector Functions-Improving Antibodies for Cancer T reatment.
3.Sweeping antibody as a novel therapeutic antibody modality capable of eliminating soluble antigens from circulation.
4.Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region.
110102000668（1）號