產(chǎn)品概述:
Cell Counting Kit-8，簡稱 CCK-8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于
細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8 在
電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色
的formazan (參考圖1) 。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，
則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺 (生成的 formazan 量) 和細(xì)胞數(shù)
目呈線性關(guān)系
操作說明
本試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物
等對細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制
檢測。
1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
a. 先用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；
b. 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做 5-7 個細(xì)
胞濃度梯度，每組 4-6 個復(fù)孔；
c. 接種后培養(yǎng) 2-4 小時使細(xì)胞貼壁，然后每 100 μL 培養(yǎng)基加 10 μL CCK-8
試劑培養(yǎng)一定時間后測定 OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD
值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。
使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是試驗條件完全一致。
2. 細(xì)胞活性檢測
a. 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)
24 小時；
b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡) ；
c. 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；
d. 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。
3. 細(xì)胞增殖-毒性檢測
a. 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)
24 小時；
b. 向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物；
c. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間；
d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；
e. 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；
f. 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。
保存條件
4°C 一年
-20°C 兩年
長期保存，建議避光
注意事項
1. CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 1-4 小時，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右即可取出肉眼
觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8 的最佳反應(yīng)時
間以具體顯色的最佳時間為準(zhǔn)。
2. 使用 96 孔板進(jìn)行檢測時，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問
題。一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈
的辦法，改加相同量的 PBS 、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置
于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。
3. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑 (例如一些抗氧
化劑) 會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。
4. 加入藥物中如含有金屬，對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為 1 mM 的氯化
亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降
低。如果終濃度是 10 mM 的話，將會 100% 抑制。
5. 培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過
扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
6. 本產(chǎn)品可以檢測 ，但不能檢測酵母細(xì)胞。向 100 μL 培養(yǎng)液
中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 小時或過夜。
7. CCK-8 試劑對細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶
液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的) 。
8. 要測定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9. 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。
10. 以下方法可以終止 CCK-8 反應(yīng) (96 孔板) ：
(a). 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C 冰箱內(nèi)。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl
溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。
注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時內(nèi)測定。
11. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不
得用于食品或藥品。
12. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
Cell Counting Kit-8，簡稱 CCK-8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于
細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8 在
電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色
的formazan (參考圖1) 。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，
則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺 (生成的 formazan 量) 和細(xì)胞數(shù)
目呈線性關(guān)系
操作說明
本試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物
等對細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制
檢測。
1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
a. 先用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；
b. 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做 5-7 個細(xì)
胞濃度梯度，每組 4-6 個復(fù)孔；
c. 接種后培養(yǎng) 2-4 小時使細(xì)胞貼壁，然后每 100 μL 培養(yǎng)基加 10 μL CCK-8
試劑培養(yǎng)一定時間后測定 OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD
值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。
使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是試驗條件完全一致。
2. 細(xì)胞活性檢測
a. 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)
24 小時；
b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡) ；
c. 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；
d. 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。
3. 細(xì)胞增殖-毒性檢測
a. 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)
24 小時；
b. 向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物；
c. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間；
d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；
e. 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；
f. 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。
保存條件
4°C 一年
-20°C 兩年
長期保存，建議避光
注意事項
1. CCK-8 的培養(yǎng)時間一般為 1-4 小時，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右即可取出肉眼
觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8 的最佳反應(yīng)時
間以具體顯色的最佳時間為準(zhǔn)。
2. 使用 96 孔板進(jìn)行檢測時，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問
題。一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈
的辦法，改加相同量的 PBS 、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置
于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。
3. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑 (例如一些抗氧
化劑) 會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。
4. 加入藥物中如含有金屬，對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為 1 mM 的氯化
亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降
低。如果終濃度是 10 mM 的話，將會 100% 抑制。
5. 培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過
扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
6. 本產(chǎn)品可以檢測 ，但不能檢測酵母細(xì)胞。向 100 μL 培養(yǎng)液
中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 小時或過夜。
7. CCK-8 試劑對細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶
液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的) 。
8. 要測定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9. 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。
10. 以下方法可以終止 CCK-8 反應(yīng) (96 孔板) ：
(a). 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C 冰箱內(nèi)。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl
溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。
注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時內(nèi)測定。
11. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不
得用于食品或藥品。
12. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
110102000668（1）號