產(chǎn)品概述
Cell Counting Kit-8，簡稱 CCK-8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于
細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8 在
電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色
的formazan 。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，
則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺 (生成的 formazan 量) 和細(xì)胞數(shù)
目呈線性關(guān)系
細(xì)胞活性檢測
1. 在96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 ml /孔 ) 。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) (在37 ℃，5% CO2的條件下 )。
2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 O.D值的讀數(shù)) 。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時(shí)。
4. 用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
5. 如果暫時(shí)不測定O.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。
在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
細(xì)胞增殖 -毒性檢測
1. 在96 孔板中配制 100 ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24小時(shí) ( 在37℃， 5% CO2的條件下 )。
2. 向培養(yǎng)板加入10 ml不同濃度的待測物質(zhì)。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 (例如: 6,12, 24 或48小時(shí) )。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 O.D值的讀數(shù)) 。
5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時(shí)。
6. 用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
7. 如果暫時(shí)不測定O.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。
在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
注意事項(xiàng)
1. CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1-4 小時(shí)，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右即可取出肉眼
觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8 的最佳反應(yīng)時(shí)
間以具體顯色的最佳時(shí)間為準(zhǔn)。
2. 使用 96 孔板進(jìn)行檢測時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意蒸發(fā)問
題。一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈
的辦法，改加相同量的 PBS 、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置
于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。
3. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑 (例如一些抗氧
化劑) 會(huì)干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測定。
4. 加入藥物中如含有金屬，對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為 1 mM 的氯化
亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降
低。如果終濃度是 10 mM 的話，將會(huì) 100% 抑制。
5. 培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過
扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對檢測造成影響。
6. 本產(chǎn)品可以檢測 ，但不能檢測酵母細(xì)胞。向 100 μL 培養(yǎng)液
中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 小時(shí)或過夜。
7. CCK-8 試劑對細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶
液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的) 。
8. 要測定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9. 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。
10. 以下方法可以終止 CCK-8 反應(yīng) (96 孔板) ：
(a). 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C 冰箱內(nèi)。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl
溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。
注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時(shí)內(nèi)測定。
11. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不
得用于食品或藥品。
12. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
110102000668（1）號(hào)